SPECTROPHOTOMETRIC ESTIMATION OF HAEMOGLOBIN

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SPECTROPHOTOMETRIC ESTIMATION    OF    HAEMOGLOBIN

 

You are    provided    with    a    standard    blood    ‘Z’    containing    12.2    g/dl    of    Heamoglobin    (based    on

1:200 dilution).    Follow    the    method    below    to    construct    a   calibration    curve    using    this    sample.

 

Method 

    

Step 1:   Calibration    Curve     

  • Make a  1:100    dilution    of    blood    ‘Z’    by    taking    1mL    of    well    mixed    blood    and    making    up    to

100mL with    ammonium    chloride

  • Mix well  and    leave    for    10mins
  • Set  up,    in    duplicate,    2    rows    of    10    tubes    and    follow    the    dilution    table    below:

 

Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1:100

dilution

0.5mL 1.0mL 1.5mL 2.0mL 2.5mL 3.0mL 3.5mL 4.0mL 4.5mL 5.0mL
Ammonium

chloride

4.5mL 4.0mL 3.5mL 3.0mL 2.5mL 2.0mL 1.5mL 1.0mL 0.5mL 0.0mL

 

  • Prepare a  reagent    blank    consisting    of    ammonium    chloride    only
  • Read the  blank    and    calibrate    the    spectrophotometer    at    wavelength    540nm.
  • Read all  the    remaining    tubes    at    540nm    and    record    the    absorbance;    remembering    you

have set    the    tubes    up    in    duplicate.

 

Step 2:    Determine    Hb    concentration    in    patient    samples    

  • You are  provided    with    samples    for    6    patients,    samples    A-­‐F
  • In duplicate,  aliquot    20mL    into    4mL    of    ammonium    chloride.
  • Perform the  same    step    with    sample    Z    as    a    quality    control    measure
  • Mix well  and    leave    for    10mins
  • Read the  absorbance    for    each    sample    at    540nm    and    record    in    a    suitable    table

 

Results 

 

Calibration Curve    

 

Complete the    table    below    and    calculate    the    relative    dilution    factors    and    concentrations    for

each tube.

    

Tubes  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10 
1:100

dilution

0.5mL 1.0mL 1.5mL 2.0mL 2.5mL 3.0mL 3.5mL 4.0mL 4.5mL 5.0mL
Ammonium

chloride

4.5mL 4.0mL 3.5mL 3.0mL 2.5mL 2.0mL 1.5mL 1.0mL 0.5mL 0.0mL
Dilution    Factor 1:200
Hb Conc    (g/dL) 12.2
Abs 1

 

0.095

 

    0.195

 

    0.300

 

    0.375

 

    0.477

 

    0.578

 

    0.666

 

    0.761

 

    0.850

 

    0.947

 

Abs 2

 

    0.094

 

0.196

 

    0.301

 

    0.375

 

    0.478

 

    0.582

 

    0.674

 

0.762

 

    0.858

 

    0.949

 

Mean

 

 

Present    your    data    as    a    calibration    curve    using    the    graph    paper    provided    over    leaf

    

Determination of   Hb    Concentration    in    patient    samples    

 

Complete the    table    below    and    provide    concentrations    for    each    of    the    samples    as    determined    by

the calibration    curve.

 

Sample 
Abs 1

 

    0.187

 

    0.208

 

    0.296

 

    0.192

 

    0.312

 

    0.258

 

    0.643

 

Abs 2

 

    0.189

 

    0.218

 

    0.297

 

    0.193

 

    0.315

 

    0.259

 

    0.645

 

Mean

 

Hb Conc    (g/dL)

 

 

8

 

Questions: 

    

Answer the    following    questions    in    the    boxes    provided:

    

  1. Why do  you    dilute    sample    Z    1:100    initially?    

    

    
    
    
    
    
    
    

        

  1. Why do  you    include    testing    sample    Z    with    the    unknown    patient    samples?    

    

    
    
    
    
    
    
    

    

  1. Why do  you    need    to read   absorbance  of   the dilutions at   540nm?  

    

    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

 

 

 

  1. Are your  results    accurate    and    how    can    you    tell?    

    

    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

  1. Whatare   the    Hb  reference   ranges    for  men,  women    and    neonates?    

    

    
    
    

    

  1. Whatis   the    definition of   anaemia?    

    

    
    
    
    
    
    
    
    
    
  1. SampleD   is  female    is  she   anaemic? 

    

    
    
    
    

 

    

 

 

  1. What effect would    a   high    white    cell    count    have    on your    haemoglobin    measurement?    

    

    
    
    
    
    
    
    

    

  1. How  is  haemoglobin  measured    in    the laboratory? 

    

    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

  1. Describe  the    structure    of  the    haemoglobin    molecule    and    describe    its    function.    

    

    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    


 

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